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技術(shù)文章

當(dāng)前位置:首頁技術(shù)文章SPE應(yīng)用一:獸藥殘留應(yīng)用

SPE應(yīng)用一:獸藥殘留應(yīng)用

更新時(shí)間:2017-10-23點(diǎn)擊次數(shù):4582

動(dòng)物組織中鹽酸克侖特羅等4種β-激動(dòng)劑藥物殘留檢測(Cleanert PCX, P/N: CX1506)

1.實(shí)驗(yàn)材料

1.1 固相萃取小柱:PCX(150mg/6mL)

1.2 四種β-激動(dòng)劑藥物:鹽酸克侖特羅、沙丁胺醇、西馬特羅、萊克多巴胺等4種β-激動(dòng)劑藥物

2. 試料的制備

取空白樣品,經(jīng)過液液萃取初步處理后,添加適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液作為空白添加試料。

3. 凈化

   依次用甲醇5mL、水5mL30mmol/L鹽酸5mL潤洗固相萃取小柱,將上述備用液過柱,依次用水5mL、甲醇5mL淋洗,真空抽干,用4%氨化甲醇5mL洗脫PCX小柱,收集洗脫液于具塞玻璃試管中,50下氮?dú)獯蹈伞T跇右哼^柱和洗脫過程中流速控制在1mL/min左右。

4. 衍生化及檢測

將上述盛有殘?jiān)木呷Aг嚬芊湃?/span>50烘箱中加熱片刻,除去水分后,加入甲苯100mL和雙*基硅基三氟乙酰胺(BSTFA100mL,渦旋振蕩20s,密封玻璃塞,置于80恒溫烘箱中加熱l小時(shí),冷卻后加入300mL甲苯,作為試樣溶液,供氣相色譜-質(zhì)譜分析。

5. 結(jié)果

5.1 回收率實(shí)驗(yàn)(精密度和準(zhǔn)確度)

將豬肝空白樣品經(jīng)過液液萃取初步處理后,分別添加一定量的標(biāo)準(zhǔn)溶液,配制1μg/L2μg/L5μg/L10μg/L100μg/L五個(gè)濃度的試樣溶液,每批次內(nèi)同一濃度做5次平行實(shí)驗(yàn),共4個(gè)批次(樣品典型回收率色譜圖見附圖)。

豬肝中實(shí)驗(yàn)結(jié)果列表如下

添加濃度

(μg/L

回收濃度

(μg/L

平均回收值

(μg/L

平均回收率

%

相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

%

1

0.75

0.72

72.40

5.93

0.67

0.72

0.70

0.78

2

1.62

1.63

81.30

1.23

1.66

1.60

1.61

1.64

5

4.02

4.24

84.80

4.16

4.10

4.27

4.38

4.43

10

8.24

8.45

84.45

2.81

8.35

8.77

8.62

8.25

100

90.24

9.12

91.15

2.86

87.15

91.77

92.62

93.95

 

5.2重復(fù)性實(shí)驗(yàn)(批間誤差實(shí)驗(yàn)):

豬肝中實(shí)驗(yàn)結(jié)果列表如下

批間

添加濃度(μg/L

1

2

5

10

100

平均

回收率%

RSD%

平均

回收率%

RSD%

平均

回收率%

RSD%

平均

回收率%

RSD%

平均

回收率%

RSD%

1

72.40

5.93

81.30

3.49

84.80

6.16

84.45

3.59

91.15

2.86

2

75.37

6.12

80.47

5.37

84.74

7.55

87.46

4.68

90.05

3.86

3

70.09

7.85

80.80

6.57

83.10

8.17

83.21

5.39

89.53

4.16

4

76.73

4.90

78.50

8.35

82.90

5.11

85.95

5.72

88.27

5.93

平均值

73.65

6.20

80.25

5.95

83.88

6.75

85.27

4.84

89.75

4.20

RSD%

12.95

10.79

9.43

7.00

5.75

 

附圖:豬肝中0.5μg/L1μg/L2μg/L5μg/L10μg/L100μg/L六個(gè)濃度檢測結(jié)果總離子流圖(TIC)代表圖譜:

liver+1ppb(pcx)

豬肉中五種磺胺藥物的檢測(Cleanert SUL-5, P/N: SUL-5)

一、實(shí)驗(yàn)材料

1SPE柱:Cleanert SUL-52g/10mL

2.五種磺胺類藥物:磺胺二甲基嘧啶(SM2)、磺胺間甲氧嘧啶(SMM)、磺胺甲唑(SMZ) 磺胺二甲氧嘧啶(SDM)、磺胺喹啉(SQ)

3.標(biāo)準(zhǔn)樣品工作液

標(biāo)準(zhǔn)樣品根據(jù)NY 5029-2001附錄E配制,濃度為10mg/kg

 

二、實(shí)驗(yàn)過程

1.柱保留回收率實(shí)驗(yàn)方法

按照NY 5029-2001附錄E中的方法進(jìn)行柱保留實(shí)驗(yàn)。具體步驟為:吸取50µL100µL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液于2.95mL2.90mL95%乙腈中溶解,然后過已經(jīng)5mL95%乙腈活化的SUL-5小柱。具體步驟如下:

1)柱平衡:95%乙腈5mL

2)上樣(95%乙腈樣品溶液 3mL

3)預(yù)淋洗:5mL95%乙腈淋洗

4)洗脫:70%乙腈10mL洗脫

收集洗脫液,進(jìn)行HPLC分析,進(jìn)樣量為20µL

2.添加回收率實(shí)驗(yàn)

按照NY 5029-2001附錄E中的方法進(jìn)行添加回收率實(shí)驗(yàn)。具體步驟為:稱取組織樣品5g(到0.01g)于已加有10g無水硫酸鈉的離心管中,然后加入乙腈25mL,10000r/min以上的速度均質(zhì)1min后,以3000r/min的速度離心5min。分離后的殘?jiān)儆?/span>25mL乙腈處理,以3000r/min的速度離心5 min。合并兩次的上清液,加入用正己烷30mL,振蕩10min,以3000r/min的速度離心5min,取下層液體,加正丙醇10mL50下減壓干燥至干,殘留物用95%乙腈3mL溶解,過堿性氧化鋁小柱。用95%乙腈5mL過柱,不收集,再用70%乙腈10mL洗脫后,收集洗脫液進(jìn)行液相色譜儀測定。

 

3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

31 柱保留回收率實(shí)驗(yàn)

Cleanert SUL-5小柱分別進(jìn)行了兩種濃度的柱保留回收率實(shí)驗(yàn),濃度設(shè)置相當(dāng)于實(shí)際樣品中含有100µg/kg200µg/kg磺胺類藥物,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1、表2,從表中可見Cleanert小柱SM2SMMSMZSDMSQ的平均回收率范圍分別為92.47~99.37%93.69~99.44%88.61~96.27%90.87~96.06%91.83~95.92%,效果良好;同樣從表中可見Cleanert小柱的批內(nèi)變異系數(shù)在0.30~9.38%之間,小柱的穩(wěn)定性較好。

32 樣品回收率實(shí)驗(yàn)

Cleanert SUL-5小柱進(jìn)行了兩個(gè)濃度的回收率實(shí)驗(yàn),每個(gè)濃度6個(gè)重復(fù),結(jié)果見表3。從表3可知Cleanert小柱在100µg/kg200µg/kg添加濃度下,豬肉中的平均回收率在80.62~94.49%范圍內(nèi),批內(nèi)變異系數(shù)在3.98~7.79%范圍內(nèi),回收率高,穩(wěn)定性好。

 

表1. Cleanert小柱保留回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(濃度相當(dāng)于組織中100µg/kg)

小柱批次

藥物種類

回收率(%)     平均回收率 (%)          RSD(%)

*批

 

 

 

 

第二批

 

 

 

 

第三批

SM2

SMM

SMZ

SDM

SQ

SM2

SMM

SMZ

SDM

SQ

SM2

SMM

SMZ

SDM

SQ

94.37       96.10      95.19      95.22       0.91

96.97       95.38      96.10      96.15       0.83

89.95       90.96      98.50      93.14       5.01

94.66       98.15      95.08      95.96       1.99

93.48       91.85      90.55      91.96       1.59

94.18       95.49      101.13     96.93       3.81

97.55       88.94      96.90      94.46       5.07

91.73       87.87      94.46      91.35       3.62

87.22       99.60      97.87      94.90       7.06

92.18       94.80      93.17      93.38       1.43

95.08       94.76      94.52      94.79       0.30

99.63       95.11      95.96      96.90       2.48

96.40       98.16      87.26      93.94       6.23

96.79       96.66      94.55      96.00       1.31

96.32       91.38      92.49      91.93       0.85

 

 

表2. Cleanert小柱保留回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(濃度相當(dāng)于組織中200µg/kg)

小柱批次

藥物種類

回收率(%)              平均回收率 (%)    RSD(%)

第三批

 

 

 

 

第四批

 

 

 

 

第五批

SM2

SMM

SMZ

SDM

SQ

SM2

SMM

SMZ

SDM

SQ

SM2

SMM

SMZ

SDM

SQ

99.66       99.26      98.75     99.22         0.46

97.46      100.25      96.37     98.03         2.04

96.35       94.42      97.06     95.94         1.42

94.97       94.86      98.34     96.06         2.06

98.22       91.96      97.59     95.92         3.59

100.45      85.90      91.06     92.47         7.97

94.67       88.58      97.83     93.69         5.02

95.96       81.25      88.63     88.61         8.30

99.83       82.87      89.90     90.87         9.38

96.21       87.89      91.40     91.83         4.54

98.69       100.31     99.11     99.37         0.85

101.51      100.78     96.04     99.44         2.99

91.35       98.78      98.68     96.27         4.43

92.75       97.29      97.88     95.97         2.92

84.27       98.61      98.20     93.69         8.71

 

 

              表3. Cleanert小柱豬肉樣品回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

添加濃度(µg/kg

藥物種類

回收率(%)                     平均回收率 (%)  RSD(%)

100

 

 

 

 

200

SM2

SMM

SMZ

SDM

SQ

SM2

SMM

SMZ

SDM

SQ

93.39   97.95   98.87   90.33   98.27   88.14   94.49   4.83

97.46   90.66   94.33   81.83   93.64   96.50   92.40   6.17

83.78   88.45   94.40   80.24   82.04   80.30   84.87   6.56

91.26   96.75   91.79   87.57   85.88   88.43   90.28   4.30

88.44   85.14   92.61   81.03   79.57   83.59   85.06   5.69

80.85   77.37   88.39   90.53   73.80   81.17   82.02   7.79

91.79   88.87   96.23   92.96   87.01   87.36   90.70   3.98

79.60   77.27   87.34   86.98   75.44   82.47   81.52   6.09

84.31   72.35   84.52   81.92   82.53   78.10   80.62   5.79

91.93   81.86   91.83   87.89   86.90   86.17   87.76   4.33

 

 

水產(chǎn)品、進(jìn)口肉中土霉素、四環(huán)素、金霉素含量檢測方法(Cleanert PS, P/N: PS2003)

 

1SPE柱:Cleanert PS柱(200mg/3mL

2.樣品處理

稱取5g經(jīng)勻漿處理的樣品于100mL離心管內(nèi),分別加入含有EDTA2Na的檸檬酸緩沖液30mL20mL,混合震蕩提取,合并上清液。加入20mL正己烷和上清液于分液漏斗中,充分混合震蕩5min,合并下層。

含有EDTA2Na檸檬酸緩沖液的配制0.1mol/L檸檬酸緩沖溶液307mL0.5mol/L磷酸氫二鈉緩沖溶液193mL混合均勻,向其中加入1.86gEDTA2Na,溶解后作為樣品提取液。

3.凈化步驟:

10mL甲醇,10mL水,5mL EDTA2Na活化PS柱,加入上清液,然后以10mL水淋洗小柱,抽干,zui后以10mL甲醇洗脫目標(biāo)物,并收集。

4.濃縮及定容:

濃縮:在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮,溫度小于40

定容:加入1.0mL1.36%的磷酸二氫鉀溶液,將定容液進(jìn)行HPLC分析

5HPLC條件

色譜柱:Venusil MP C18, 5µm,4.6*250mm

流動(dòng)相:A:B=77:23

A:咪唑緩沖液稱取68.08咪,10.72乙酸鎂,0.37EDTA2Na 溶于800mL水中,用冰乙酸調(diào)pH7.2,加水定容到1000mL.

B:乙腈

6.結(jié)果:(兩個(gè)平行)

名稱

回收率-1

回收率-2

土霉素

128%

137%

四環(huán)素

91.8%

97.4%

金霉素

88.5%

87.1%

強(qiáng)力霉素

97.3%

95.3%

                                                                                                                                                                     

蜂蜜中四環(huán)素檢測(Cleanert PEP,Cleanert COOH,P/N:PE5006,CH5003)

  1. 樣品制備:稱6g蜂蜜樣品+30mL提取液(PH=4.0),旋渦振蕩

提取液配制:檸檬酸10.5g+磷酸氫二鈉(無水)8.88g+乙二胺四乙酸鈉30.3g+820mL水,用2M HCl調(diào)PH4.0

2SPE步驟

PEP(500mg/6mL)

   活化:甲醇,水

   上樣:把樣品提取液過柱

   淋洗:5%甲醇/ 5mL,抽干

COOH(500mg/3mL)

  活化:乙酸乙酯,2柱管

PEP(上)-COOH(下) 串聯(lián)

 淋洗: 15mL乙酸乙酯淋洗,拿下PEP柱,COOH柱抽干(5min

 洗脫: 流動(dòng)相(0.01M草酸:乙腈:甲醇=350100504.5mL

 定容: 洗脫液用0.01M草酸定容至5mL,搖勻,過濾膜,UPLC測定。

硝基呋喃類代謝物殘留量的LC/MS測定方法 (Cleanert PEP,P/N:PE0603)

1.材料:SPE柱:PEP(60mg/3mL)

2.樣品制備

21 奶粉和牛奶樣品處理

2.1.1 樣品處理:奶粉1g(牛奶稱5g),加15 mL三氯乙酸-水混合溶液(2+15mol,加內(nèi)標(biāo),加混標(biāo),37.5水浴水解5小時(shí),取出后4000 rpm離心5min,取上清液待用。

2.1.2  樣品初步凈化及衍生:PEP柱以5mL甲醇,5mL水活化,后把2.1.1處理好的上清液過柱,待樣液全部通過固相萃取柱后用5ml的三氯乙酸淋洗全部收集到另一個(gè)管中,加100μl衍生劑(20mg而硝基苯甲醛溶于1ml二甲亞砜),放入37.5水浴中衍生16小時(shí)(過夜)。

22 豬肉、牛肉、雞肉、豬肝和水產(chǎn)品和蜂蜜樣品處理

2.2.1樣品粗處理:豬肉、牛肉、雞肉、豬肝和水產(chǎn)品稱2g(蜂蜜稱5g),加入15mL甲醇-水混合溶液(2+1),渦旋,混勻, 4000 rpm離心5min,吸取上清液,加入內(nèi)標(biāo)及混標(biāo)。

2.2.2 衍生:在上述上清液中加100μL衍生劑(20mg而硝基苯甲醛溶于1mL二甲亞砜),放入37.5水浴中衍生16小時(shí)(過夜)。加磷酸氫二鉀緩沖液5mLpH約為7.4),4000 rpm離心10 min,(若待測樣品含脂肪較多,上清液加5 mL正己烷,振蕩2 min4000 rpm離心10 min吸取并棄掉正己烷)

3PEP柱凈化

1) 活化:PEP柱以5mL甲醇,5mL水活化

2) 上樣:將2.2.12.2.2中的衍生液加磷酸氫二鉀緩沖液5ml,用1mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液pH約為7.44000 r/min離心10 min,上清液(若待測樣品含脂肪較多,上清液加5 mL正己烷,振蕩2 min4000 r/min離心10 min吸取并棄掉正己烷)以小于2 mL/min的流速通過PEP

3) 淋洗:以10 mL水洗滌固相萃取柱,棄去全部流出液。用真空泵在65 kPa負(fù)壓下抽干PEP固相萃取柱15 min

4) 洗脫:用5 mL乙酸乙酯洗脫被測物于25 mL棕色離心管中。

5) 濃縮:洗脫液在40水浴中氮?dú)獯蹈桑脴悠范ㄈ菀喝芙獠⒍ㄈ葜?/span>1.0 mL,混勻后過0.2μm濾膜用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

 

動(dòng)物性食品中糖皮質(zhì)激素類藥物多殘留LC/MS檢測方法 (Cleanert Silica, P/N:SI5006)

1.固相萃取柱:Cleanert Silica500mg/6ml

2.提取

2.1肌肉組織樣品

稱取組織試料5g±0.05g)于50mL離心管中,加30mL乙酸乙酯, 10g無水硫酸鈉,均質(zhì)1min200r/min搖床振動(dòng)20 min4200r/min離心10min,移取乙酸乙酯層。殘?jiān)屑右宜嵋阴?/span>25mL, 均質(zhì)1min200r/min搖床振動(dòng)20 min4200r/min離心10min,移取乙酸乙酯層。合并兩次提取液,40旋轉(zhuǎn)至近干,加乙酸乙酯1mL和正已烷5mL,溶解殘?jiān)?/span>,待凈化。

 2.2 牛奶、雞蛋樣品

稱取牛奶或雞蛋試料5g±0.05g)于50mL離心管中,加30mL乙酸乙酯,均質(zhì)1min200r/min搖床振動(dòng)20 min4200r/min離心10min,移取乙酸乙酯層。殘?jiān)屑右宜嵋阴?/span>25mL,均質(zhì)1min200r/min搖床振動(dòng)20 min4200r/min離心10min,移取乙酸乙酯層。合并兩次提取液,40℃旋轉(zhuǎn)至近干,加乙酸乙酯1mL和正已烷5mL,溶解殘?jiān)?/span>,待凈化。

3.凈化

   用正已烷6mL活化Silica,提取液過柱。用正已烷6mL淋洗萃取柱,抽干,用正已烷-丙酮(6/4,V/V)6mL洗脫。洗脫液50氮?dú)獯蹈桑?/span>20%乙腈水溶液0.5mL,溶解殘?jiān)D(zhuǎn)入1.5mL離心管中,4200r/min離心20min,取上清液,過0.22um濾膜,供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定。

 

動(dòng)物源食品中玉米赤霉醇類藥物殘留LC/MS檢測 (Cleanert NH2, PAX, P/N:NH5006, AX1506)

1.SPE柱:Cleanert NH2:500mg/6mL, PAX: 150mg/6mL

2.樣品處理

2.1肌肉組織樣品

 2.1.1 提取:稱取5g±0.05g)于50mL離心管中,加甲醇15mL,渦旋1min,4000r/min離心10min,取上清液于另一離心管中。重復(fù)提取一次,合并兩次提取液。加正已烷20mL,手搖20次,3000r/min離心5min,棄上層正已烷。再加正已烷20mL重復(fù)脫脂一次。下層轉(zhuǎn)至100mL雞心瓶中,50旋蒸至近干,加乙酸乙酯5mL,渦動(dòng)1min,靜置10s,上清液轉(zhuǎn)移至同一個(gè)離心管。再用正已烷10mL洗滌雞心瓶一次,合并三次殘余物溶解液,備用。

2.1.2凈化:氨基柱上加無水硫酸鈉2g,用玻璃棒敲勻。依次用乙酸乙酯和正已烷各5mL活化,取備用液全部過柱,再依次用正已烷、正已烷-乙酸乙酯(60+40,v/v)5mL淋洗。依次用正已烷-乙酸乙酯(20+80V/V)和乙酸乙酯各4mL洗脫,合并兩次洗脫液,50氮?dú)獯蹈伞?/span>

2.1.3凈化:殘余物中加乙腈0.5mL,渦動(dòng)1min,加水0.5mL,混勻,過0.2um有機(jī)濾膜,供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

2.2 肝臟組織樣品

2.2.1 稱取5g±0.05g)于50mL離心管中,加甲醇10mL,渦旋1min,4000r/min離心5min,取上清液于另一離心管中。重復(fù)提取一次,合并兩次提取液。加正已烷10mL,手搖20次,3000r/min離心5min,棄上層正已烷。下層于50氮?dú)獯蹈桑右宜嵋阴?/span>5mL,渦動(dòng)1min,再加正已烷20mL渦動(dòng)30s, 4000r/min離心5min,取上清液備用。

2.2.2 凈化:氨基柱上加無水硫酸鈉2g,用玻璃棒敲勻。依次用乙酸乙酯和正已烷各5mL活化,取備用液全部過柱,再依次用正已烷、正已烷-乙酸乙酯(45+55,v/v)5mL淋洗。依次用正已烷-乙酸乙酯(20+80V/V)和2%甲醇乙酸乙酯各5mL洗脫,合并兩次洗脫液,50氮?dú)獯蹈伞?/span>

2.2.3凈化:殘余物中加乙腈0.5mL,渦動(dòng)1min,加水0.5mL,混勻,加正已烷2mL,渦動(dòng)30s,9000r/min離心5min,取下層清液,過0.2um有機(jī)濾膜,供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

2.3 牛奶樣品

2.3.1 提取:量取5.0mL試料于50mL離心管中,加18%的硫酸溶液0.1mL,渦勻,靜置10min,加正已烷10mL和乙腈20mL300r/min振蕩10min4000r/min離心10min,棄正已烷層。取提取液12.5mL于離心管中,50氮吹至小于0.1mL。加水10mL,5mol/lNaOH調(diào)節(jié)Ph值至119000r/min離心5min,備用。

2.3.3 凈化:Cleanert PAX固相萃取柱依次用甲醇、水各2mL活化和平衡,將備用液過柱,依次用甲醇-氨水-水(5+5+90,V/V/V1mL和甲醇0.5mL洗滌,用2%乙酸乙腈4mL洗脫,收集洗脫液,50下氮?dú)獯蹈伞?/span>

2.3.3凈化:殘余物中加乙腈0.5mL,渦動(dòng)1min,加水0.5mL,混勻,過0.2µm有機(jī)濾膜,供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

2.4 雞蛋樣品

2.4.1提取:稱取5g±0.05g)于50mL離心管中,加乙腈10mL,渦動(dòng)1min,9000r/min離心5min,取上清液于另一立新觀眾。重復(fù)提取一次,合并兩次提取液。取12.5mL于離心管中,50氮吹至小于0.1mL。加水10mL,5mol/lNaOH調(diào)節(jié)Ph值至119000r/min離心5min,備用。

2.4.2凈化:Cleanert PAX固相萃取柱依次用甲醇、水各2mL活化和平衡,將備用液過柱,依次用甲醇-氨水-水(5+5+90,V/V/V1mL和甲醇0.5mL洗滌,用2%乙酸乙腈4mL洗脫,收集洗脫液,50下氮?dú)獯蹈伞?/span>

2.2.3凈化:殘余物中加乙腈0.5mL,渦動(dòng)1min,加水0.5mL,混勻,過0.2µm有機(jī)濾膜,供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

 

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